Одной строкой:

Конференции оториноларингологов

Элеос - санаторный уикэнд

Чекан В.Л., Квачева З.Б., Петрова Л.Г., Левченя М.B., Гончаров А.Н.
ГУО «Белорусская медицинская академия последипломного образования»
ГУ «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии»

В статье рассматриваются особенности роста и морфологического состава культивируемых клеток эпителия слизистой оболочки гортани при стимуляции их фактором роста кератиноцитов (KGF), определяется фенотипический состав полученных в культуре эпителиальных клеток с использованием моноклональных антител CD49F. 

Введение.

Основной причиной хронических заболеваний верхних дыхательных путей является нарушение функции мерцательного эпителия с последующим развитием процессов, приводящих к повреждению слизистой оболочки. Трансплантация культуры клеток эпителия на повреждённую поверхность слизистой оболочки верхних дыхательных путей позволит добиться восстановления целостности и функции эпителиального покрова, тем самым предупредить рецидивирование и хронизацию заболеваний. В последние годы перспективным и быстроразвивающимся направлением в трансплантологии для восстановления утраченной структуры и функции повреждённых органов является использование клеточных культур и тканей. Исследования показали, что трансплантация лишь клеток отдельных органов и небольших фрагментов тканей в определённой степени может решить задачи органной пересадки. При этом удаётся избежать нежелательных эффектов, которые присущи трансплантации целых органов, а пересадка 3-5% клеток или тканей от объёма соответствующего органа могут полностью обеспечить его функцию [1,2]. В настоящее время активно используются и разрабатываются методы клеточной терапии в кардиологии, коррекции нейродегенеративных заболеваний и травматических повреждений с использованием трансплантации стволовых клеток и клеток предшественников [3]. Наиболее широкое  практическое применение получили культуры клеток эпидермиса для восстановления кожного покрова ожоговых больных [4,5,6,7]. Используя культивируемый эпителий удавалось путём поэтапной имплантации восстановить до 50% эпидермиса при ожогах 90% всей поверхности тела [4]. Современные клеточные технологии для восстановления кожного покрова основаны на выращивании в культуре эпителиальных пластов кератиноцитов или фибробластов для приготовления живых эквивалентов кожи и их трансплантации на поражённые участки кожи [6,7]. Имеются данные по использованию аллогенных фибробластов в оториноларингологии [8]. В настоящее время разработаны технологии культивирования большинства клеток вне организма. Предложены питательные среды для их роста с использованием различных факторов роста: эпидермальный фактор роста, фактор роста тромбоцитов, фактор роста кератиноцитов и т.д.[9,10,11,12,13,14]. Shaw и др. подробно описаны методики получения первичных и пассируемых культур клеток эпителиальной ткани, однако используемые способы требуют совершенствования, оптимизации. Исследования по культивированию эпителия слизистой оболочки верхних дыхательных путей не многочисленны и для избирательного роста эпителиальных клеток необходимо определение видовой специфичности клеток в культуре.

Цель исследования: оптимизация условий культивирования эпителиальных клеток слизистой оболочки гортани при использовании фактора роста кератиноцитов (KGF).

Материалы и методы.

Источником для получения культур эпителиальных клеток гортани явились 2 биопсийных образца слизистой гортани человека, полученные от пациентов разного возраста (19 и 40 лет). Образцы слизистой оболочки гортани получали из удаленных тканей (для гистологического исследования) во время хирургических вмешательств в асептических условиях. Образцы ткани помещались во флаконы с питательной средой ДМЕМ (Дульбекко модифицированная питательная среда Игла), содержащей антибиотики: гентамицин (150 мкг/мл) и амфотерицин Б (10 мкг/мл), тотчас же транспортировались в лабораторию, хранились при +40С не более 4-х часов.

Для отделения эпителия слизистой оболочки, образцы ткани подвергали обработке 0,25 % раствором диспазы  в течение 18-20 часов при +4 оС. Затем отделяли поверхностный слой по линии базальной мембраны. Кусочки ткани эпителия слизистой оболочки измельчали на отдельные фрагменты, обрабатывали 0,25 % раствором трипсина (Sigma, США) в течение 30 мин при + 37 С. По истечении указанного времени флаконы извлекали из термостата, ферменты нейтрализовали добавлением 10 % эмбриональной сыворотки. Полученные суспензии клеток пропускали через стерильные фильтры с диаметром пор 200 мкм, затем клетки осаждали центрифугированием при 1200 об/мин в течение 10 минут. Осадки ресуспендировали в питательной среде ДМЕМ с 10% сыворотки и гентамицином – 50 мкг/мл. Количественный выход жизнеспособных клеток определяли при их окраске 0,5% раствором трипанового синего и  подсчете в камере Горяева. Посевная доза клеток составляла 500 тысяч в 1мл ростовой среды.

Культивирование клеток проводили в СО2-инкубаторе при 37oС. Смену среды осуществляли через каждые 3 дня. Наблюдение за ростом клеток проводили в течение 10-12 дней с использованием светового микроскопа.

В работе применяли Дульбекко модифицированную питательную среду Игла с низким содержанием Са2+ (0,05мМ), (Sigma, США). В качестве добавок к питательной среде использовали:

KGF, 20 нг/мл (Stem Сеll  Technologies, Канада),

эмбриональная сыворотка, 10% (Sigma, США).

Для культивирования эпителиальных клеток использовали пластиковые (полистирол) флаконы, с площадью ростовой поверхности  25 см2, обработанные коллагеном типа 1А и обладающие высокой адгезивной способностью, предназначенные для культивирования эпителиальных клеток (фирма Соstar, США).

В постановке прямого метода флуоресценции антител и метода  проточной цитофлуориметрии использовали моноклональные антитела к альфа интегринам СD49f, меченные FITC (Stem Сеll  Technologies, Канада);

Для анализа методом прямой иммунофлуоресценции и проточной цитофлуориметрии клетки в культуральной среде центрифугировали в пробирках 10 минут при 1200 об/мин, надосадок удаляли. Осадок ресуспендировали в форфатном буфере Дульбеко  объёмом 200 мкл. К осадку в виде клеток дабавляли  моноклональные антитела СD49f (Stem Сеll  Technologies, Канада) и ставили на 30 минут в холодильник при +2-4 оС. После контакта с антителами часть клеток  исследовали в флуоресцентном микроскопе общепринятым методом. Другую часть клеток анализировали на проточном  цитофлуориметре FacsCalibur (Becton Dickinson).

Результаты.

Для получения культуры обогащенной эпителиальными клетками, важным условием является подбор ростовой среды с факторами роста, которые стимулировали бы преимущественный рост эпителиальных клеток. С этой целью нами оценено влияния фактора роста кератиноцитов на эпителиальные клетки слизистой гортани в условиях культуры. При использовании в качестве питательной среды Дульбеко модифицированную среду Игла с низким содержанием кальция и магния и c 10% сывотки эмбрионов коров, а также добавлением KGF в дозе 20 нг\мл, обеспечивался интенсивный рост и пролиферация клеток. При этом небольшая часть диссоциированных клеток слизистой гортани адгезировалась и распластывалась на флаконе покрытом коллагеном типа 1, остальные клетки образовывали пролиферирующие колонии (конгламераты ) клеток в суспензии. Количество колоний клеток увеличивалось и достигало своего максимального количества на 7-14 день. Для длительного поддержания в культуре и накопления их биомассы, клетки рассевались в соотношении 1:2 с добавлением свежей ростовой среды, содержащей KGF в той же дозе. Культивирование клеток и наблюдение за ними проводили  в течение 2,5-х месяцев с 5-ю пересевами (пассажами). Индекс пролиферации клеток  (отношение количества выросших клеток к посеянным) составлял от 2 до 3. Морфологический анализ клеток в динамики роста культур выявил постоянство их фенотипов, при использования ростовой среды, содержащей KGF.

Как видно из данных, представленных на рисунке 1А, конгломераты клеток представлены однотипными или находящимися в стадии деления округлыми клетками, являющимися предшественники эпителиальных клеток, которые способны к размножению. Единичные клетки или группы адгезированных клеток представлены несколькими фенотипами – дифференцированными клетками, имеющими крупные размеры, кубовидной или полигональной формы, с небольшим центрально расположенным ядром (рис. 1А, Б). Выявлено, что крупных размеров кубовидной формы клетки содержат вакуоли и по всей вероятности принадлежат к секреторным клеткам, продуцирующим муцин (рис. 1Б).  

Исследование роста и развития в культуре эпителиальных клеток слизистой оболочки гортани человека при их стимуляции фактором роста кератиноцитов - doctor.by  
Рисунок 1. Морфология культуры клеток эпителия гортани человека. А – 7-й день культивирования; длинная стрелка - колония пролиферирующих клеток-предшественников; короткая стрелка - группа эпителиальных клеток в стадии терминальной дифференцировки. Световая микроскопия живой культуры, увеличение 200х


Исследование роста и развития в культуре эпителиальных клеток слизистой оболочки гортани человека при их стимуляции фактором роста кератиноцитов - doctor.by  
Рисунок 1. Морфология культуры клеток эпителия гортани человека.Б - 14-й день культивирования; прерывистая стрелка – секреторные клетки. Световая микроскопия живой культуры, увеличение 200х 


Фибробластоподобных клеток визуально не выявлено. Для установления природы клеток проведено их фенотипирование с использованием моноклональных антител к альфа интегринам (СD49f). С использованием метода флуоресцирующих антител нами было установлена экспрессия рецептора альфа-интегрина на поверхности культивируемых клеток. Как видно из рисунка 2, клетки в разной степени экспрессируют данный маркер, что выражается интенсивностью свечения клеток. Отмечено небольшое  содержание маркера или полное его отсутствие в дифференцированных, адгезированных и распластанных клетках полигональной формы, что подтверждает их переход в терминальную стадию дифференцировки. Небольших размеров округлые клетки, одиночные или в составе кластеров, имеют ярко выраженное свечение, что свидетельствует об их принадлежности к стволовым и клеткам предшественникам эпителиальных клеток.

Методом проточной цитофлуориметрии был проведен  количественный анализ клеток, экспрессирующих маркер CD49f. Как видно из цитограммы  

Исследование роста и развития в культуре эпителиальных клеток слизистой оболочки гортани человека при их стимуляции фактором роста кератиноцитов - doctor.by  
Рисунок 2. Экспрессия молекулы CD49f на поверхности  эпителиальных клеток слизистой оболочки гортани. Длинная стрелка  - эпителиальные клетки в стадии терминальной дифференцировки;
Короткая стрелка - колония пролиферирующих клеток-предшественников;
Люминисцентаная микроскопия, прямой метод флуоресцирующих антител, увеличение 400х 


светорассеяния клеток (рис. 3), культура представлена гетерогенной популяцией клеток. Для последующего анализа, в цитограмме было  выделено 3 области (R1,R2 и R3), соответственно размеру клеток. В каждой из областей клетки анализировались и высчитывался процент клеток экспрессирующих молекулы адгезии CD49f. Как видно из цитограммы флюоресценции в координатах FL1 и FL2  (рис. 4) наблюдается высокая степень экспрессии данного маркера на поверхности эпителиальных клеток. Среднее значение количества клеток экспрессирующих маркер CD49f составляет 96%.

 Исследование роста и развития в культуре эпителиальных клеток слизистой оболочки гортани человека при их стимуляции фактором роста кератиноцитов - doctor.by
Рисунок 3. Цитограмма светорассеяния эпителиальных клеток слизистой гортани в культуре (14 дней роста in vitro). Метод проточной цитофлуориметрии.


Исследование роста и развития в культуре эпителиальных клеток слизистой оболочки гортани человека при их стимуляции фактором роста кератиноцитов - doctor.by  
Рисунок 4. Цитограммы флюоресценции в координатах FL1 и FL2 эпителиальных клеток слизистой гортани в культуре области R1(14 дней роста in vitro). К – контроль,О – опыт. Метод проточной цитофлуориметрии.


Заключение.

Таким образом, полученные результаты позволяют сделать следующие выводы:
1) Клетки слизистой оболочки гортани имеют рецепторы к фактору роста кератиноцитов, который стимулируют их пролиферацию и их накопление в условиях культуры.
2) Фенотипический состав полученных в культуре эпителиальных клеток с использованием моноклональных антител CD49F выявил их гетерогенный состав: клетки предшественники эпителиальных клеток ( с высокой прлиферативной активностью) формируют колонии, обладающие адгезией к субстрату и продуцирующие муцин.
3) Разработанные условия культивирования обеспечивают накопление биомассы клеток, которые в течение 10-14 дней обеспечивают прирост в 2-3 раза.

Дальнейшие исследования позволят изучить возможность применения данной культуры клеток в эксперименте и клинической практике.

Список литературы:

  1. Грищенко В.И. Клеточная и тканевая трансплантация // Лiкування та дiагностика.- 2001.- №3.- С. 14-18
  2. Трансплантация продуктов эмбриофетоплацентарного комплекса в оториноларингологии: первые итоги и перспективы / А.С.Журавлёв, Е.В.Пущина, М.В.Калашник, Альмашни Зияд // Журн. вушних, носових i горлових хвороб.- 2003.- № 3.- С. 27-31.
  3. Пыко И.В. Мезенхимальные стволовые клетки костного мозга: свойства, функции, возможности использования в регенеративной и восстановительной терапии / И.В.Пыко, С.В.Корень, З.Б.Квачева, А.С.Федулов // Медицинский журнал. – 2007. - №4 – С. 18-22.
  4. Грин Г. Использование культур клеток для лечения болезней // В мире науки.- 1992.- №1.- С. 52-59.
  5. Терских В.В. Эпидермальные кератиноциты человека и животных: Проблемы культивирования и трансплантации / В.В.Терских, А.В.Васильев.- М.: Наука, 1995.- 104 с.
  6. Малахов С.Ф., Парамонов Б.А., Емельянов А.В., Васильев А.В., Терских В.В. Новые подходы к лечению тяжелых ожогов: трансплантация выращенных в культуре кератиноцитов // Военно-медицинский журнал,- 1997,-  Том 318,-  №9, -  стр.16-19.
  7. Туманов В.П. Лечение ожоговых ран при использовании культивированных клеток кожи человека // Педиатрия.- 1999.- № 5.- С. 52-59.
  8. Проблемы применения аллотрансплантатов в оториноларингологической практике / Д.А.Затолока, Т.А.Путилина, А.С.Затолока, В.В.Батов // Клинико-лабораторные аспекты метаболической терапии: Сб. ст. II Респ. конф.- Витебск, 1999.- С. 165-167.
  9. Иммобилизованные клетки и ферменты. Методы: Пер. с англ. / Под ред. Дж. Вудворда.- М.: Мир, 1988.- 215 с.
  10. Культура животных клеток. Методы: Пер. с англ. / Под ред. Р. Фрешни.- М.: Мир, 1989.- 333 с.
  11. Epithelial cell culture. A Practical Approach / Edited by A.J. Shaw.- Oxford University Press, 1996.- 218 s.
  12. Li A., Simmons P. J., Kaur P. Identification and isolation of candidate human keratinocyte stem cells based on cell surface phenotype // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. – 1998. – Vol. 95, – P. 3902-3907.
  13. Peter H. Michelson. Keratinocyte growth factor stimulates bronchial epithelial cell proliferation in vitro and in vivo / Peter H. Michelson, Margaret Tigue, Ralph J. Panos, Peter H.S. Sporn // Am.&Physiol Lang Cell Mol. . – 2007. – Vol.277, – P. 737-742.
  14. Robinson C.B. Culture of Conducting Airway Epithelial Cells in Serum-Free Medium / C.B.Robinson, R.Wu // J.Tiss. Cult. Meth.- 1991.- Vol. 13.- P 95-102.

медицина в рб

Исследование роста и развития в культуре эпителиальных клеток слизистой оболочки гортани человека при их стимуляции фактором роста кератиноцитов - doctor.by

Международные конференции

Белорусское общество отоларингологов предлагает посетить  международные конференции в Египте, Амстердаме, Вене. Приглашения и формы заявок можно увидеть в разделе ЛОР-общество

Новости медцентров

Как ухаживать за зубными имплантами

Как ухаживать за зубными имплантами

Как ухаживать за имплантами зубов? Успешно проведённая имплантация и пожизненная гарантия производителя зубных конструкций иногда расслабляют пациентов, позволяя думать, что уход за имплантами не обязателен. Каких-то специальных процедур действительно не...